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高效液相色谱方法的选择

点击次数:2019/10/31 14:28:22 发布时间:77
高效液相色谱方法的选择

一、色谱方式的选择

(一)样品性质

高效液相色谱方法有很多方式,选择哪种方式能满意分析的要求,首要要考虑分析目标的物理和化学性质。也便是要考虑:

① 样品是大分子仍是小分子?分子量在什么规模?

② 样品是水溶性仍是有机溶剂可溶性?

③ 样品是离子情况还是非离子情况?

(二)依据样品性质选择合适的方式

在选择高效液相色谱方式时,首要要了解的是样品的溶解性,假设不知道它的溶解性,可以用戊烷或氯仿和水作溶剂做一下溶解实验,假设知道所做样品的化学结构也可以估量它在水或有机溶剂中的溶解性。其次,要了解的是样品样品的分子量巨细,假设不知道样品的分子量,可以用体积排阻色谱法分离,得出数据。按照排阻色谱法,既可以用于水溶性样品又可以用于油溶性样品的分离。用排阻色谱法可以估量样品简略仍是复杂,用排阻色谱法也可以分离分子量巨细不一的组分。可用它来查询样品中是否含有一些分子量很接近的组分,假设样品中只含有分子量不同不大的组分,就需要运用高效液相色谱法的其他方式进行分离。

1、水溶性样品

假设是低分子量的样品,而且分子量相差较大,运用小孔填料的排阻色谱法进行分离是比较合适的。假设样品中的分子量相差不大,就要查询样品中是否含有离子型或可电离的组分,如样品中都对错离子型的,*选用键合相色谱分离,而且应首要试用反向色谱。

   假设是低分子量离子型(或是可电离的)样品,有几种方法可以使用,若为弱酸或弱碱,*为简略的方法便是完全克制的电离。例如羧酸样品中运用pH值为1-2之间的活动相,就可以把样品作为非离子型样品进行分离。但对强碱性样品(pKa>6)不能运用离子克制技术,因为不行能把活动相的pH值增大到足以克制样品电离而又不损坏固定相基质的程度。强碱性样品应和强离子型样品相同,用离子对色谱进行分离。

强离子型水溶性大分子是现在高效液相色谱法的重要课题。像蛋白质、核酸的分离是近几年研讨十分活泼的领域。

 HPLC是分离分析生物大分子生化样品中运用*为广泛的方法,各种分离方式(反向色谱、正向离子交换色谱、体积排阻色谱、疏水作用色谱和亲和色谱等)都有运用。所用的反向色谱柱多为C18----C8的键合硅胶填料,这种填料有较大的微孔,并把键合往后剩余的硅醇基用三甲氯硅烷封闭。

2、油溶性样品

  在分离油溶性样品时,开始的过程与水溶性样品相似,首要应运用体积排阻色谱法承认样品分子量巨细的特征。分子量较大的样品可以用恰当的打孔硅胶或有近凝胶填料,以有机溶剂为活动相做进一步的分离。关于分子量规模在1000--5000的样品,可以运用排阻色谱或硅胶吸附色谱。

   关于分子量低于2000的样品,假设样品中只要几个组分,而且分子量相对较大,运用小孔硅胶或其他凝胶填料的排阻色谱更简略完成分离,在此情况下也可以运用反向色谱进行分离。

关于非离子型样品,假设是强亲酯性的,可以运用有机溶剂为活动相的硅胶吸附色谱。

二、色谱条件的选择

在色谱方式选定之后,就要承认分的色谱条件,各种色谱方式的条件虽各有特点,但是不外乎是:色谱柱、活动相、梯度或等度洗脱、活动相六度等,下面把选择的一般程序列于图1-1的流程中(节选色谱分析概论)

1-1 高效液相色谱条件选择程序

  

 
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